空间多组学揭秘AKI向CKD转变的关键巨噬细胞亚群巨噬细胞（Mac）作为国家自然科学基金的研究热点，因其在免疫应答、炎症调节和组织修复中发挥的重要作用而备受关注，常年占据国自然中标关键词三巨头的位置，在近五年的国自然中标关键词“争霸赛”中，『巨噬细胞』更是有超过龙头老大『免疫』之势。它们不仅是机体免疫系统的“守门员”，还能在肿瘤微环境中影响肿瘤的生长与转移。此外，随着研究技术的进步，科学家们对Mac的多样性及其功能的理解不断深入。这些研究不仅在基础科学领域取得了重要进展，也为临床医学提供了新的治疗靶点和策略，使Mac的研究成为当前生物医学领域的前沿热点。2024年8月9日，东南大学刘必成教授及吕林莉教授团队在Advanced Science（IF=14.3）上发表题为“Identification of a Novel ECM Remodeling Macrophage Subset in AKI to CKD Transition by Integrative Spatial and Single-Cell Analysis”的研究论文[1]，在这篇文章中作者通过单细胞RNA测序和空间转录组学、mIHC等多种技术来探究急性肾损伤（AKI）—慢性肾脏疾病（CKD）小鼠模型中单侧缺血再灌注损伤（UIR）后的Mac异质性。

文章解析

UIR小鼠的单细胞转录组图谱

研究者采用UlR技术来构建小鼠AKI向CKD过渡模型，并进行了scRNA-Seq以阐明基线及UlR后第1天、第3天、第14天和第28天的肾脏细胞景观，AKI向CKD转变过程中主要涉及单核细胞/树突状细胞/Mac等。在UlR后，近端肾小管细胞（PT）的比例在第1天急剧下降至对照组的69.6%（与90.5%相比），但在第3天逐渐反弹至84.3%，随后在UlR的慢性阶段出现下降（第14天和第28天分别为74.5%和75.9%）。与此相反，免疫细胞的比例在第1天迅速增加至11.7%，并在第14天达到峰值16.9%，这与之前的报道一致，其中Mac（C1qa、C1qa和CD74高表达）成为最大的群体，占免疫细胞群体的21.4%。

图1 UIR术后的主要细胞动力学（源自论文[1]）

主要细胞类型在UlR后的空间动态

研究者对基线以及术后1天、3天、14天和28天的冷冻肾脏进行了空间转录组分析，以揭示AKl进展过程中肾细胞的空间动态情况。基于所有样本中细胞类型组成的无监督聚类分析识别出四个聚类，定义为主要组织形态区域，包括皮质、外髓（包括外带和内带）以及内髓。研究发现外髓的外带是损伤程度最高的部位，并且Mac、中性粒细胞、成纤维细胞和PT之间高度依赖。在早期AKl阶段，Mac和中性粒细胞侵入受损区域，从早期AKI到慢性CKD阶段，Mac与成纤维细胞的共定位增加。

图2 UIR术后主要细胞类型的空间动态（源自论文[1]）

Mac的异质性及其在UlR后的动态变化

研究者对髓系细胞进行了亚型聚类分析，将其分为11个类别，包括单核细胞群体（Cluster1），6种Mac群体（Cluster2-7）和树突状细胞群体，详细分析其中7种具有独特基因表达模式的单核细胞、Mac群体。单核细胞在第1天在肾脏中的积累水平最高，表明损伤后早期招募了单核细胞至肾脏。Cluster2和3高表达了典型的单核细胞招募标记基因如Ccr2，Cx3cr1，Ccl2，Ccl3及Ccl4，并且Cluster2在第1天就被招募至肾脏，表明它们来源于骨髓来源的单核细胞。Cluster2 Mac还表达了Trem2（这是感知组织损伤、吞噬凋亡碎片以及激活强烈免疫重塑的主调控者），因此，研究者将这些细胞命名为"基质重塑相关Mac”（EAMs）。经研究表明促炎性Mac促进了慢性炎症的发生，而促修复性Mac在急性肾损伤后早期出现，并在慢性阶段持续下降。损伤肾脏中早期出现并持续存在的效应EAMs在整个疾病过程中与基质稳态紧密相关。

图3 单核/Mac的亚聚集（源自论文[1]）

AKI转变为CKD过程中EAMs的动态功能

 

考虑到EAMs的独特特性，研究者进一步探讨了EAMs在AKl转变为CKD过程中的功能意义。与其它Cluster的Mac相比，EAMs在损伤程度最高的外带区域表现出密集聚集，并显示出基质重塑和吞噬作用的富集。在UIR后1天EAMs显示出促进细胞外基质（ECM）存积以及金属蛋白酶的高表达。空间转录组分析揭示了在UIR后第1天受伤外带区域中Tgfbi和Mmp9的表达增加，支持这一Cluster促进了受伤区域的ECM存积，从而在AKI早期促进组织修复和重塑。在UlR后第3天，吞噬作用和脂肪代谢基因（Fabp5，Trem2，Ctsb，Ctsd，Apoe，Lipa，Lpl，Apoc2，Fabp4，Plin2，Tbxas1，Abhd12，Pla2g7，Npc2，Soat1，Gde1，Sptssa，Sh3glb1）在EAMs中特异性上调。空间转录组数据集可视化这些标记物，表明从第3天开始，受伤外带区域富含与脂质代谢相关的基因，突出了其在脂质代谢中的作用。在晚期慢性阶段（第14天和第28天），EAMs表达具有纤维化功能的已知病理性功能基因，如IGF1，Mmp12，Tgfb1，Tl2r，Tnf，Timp2，Anxa5，Pdgfa，并在第14天达到最高纤维化评分。此Cluster中观察到高水平的MmP12、Mmp9，这可以减少基质降解并增强纤维化反应。此外，编码胰岛素样生长因子IGF家族蛋白质成员、已知促进成纤维细胞生存的IGF1的表达逐渐增加并在Mac中特异性表达。EAMs在缺血早期（第1天和第3天）具有高ECM评分，在慢性阶段（第14天和第28天）具有高纤维化评分，因此得出结论，EAMs在AKI后早期出现，并持续到慢性阶段，参与了AKI向CKD过渡过程中ECM重构的动态过程。

图4 ECM重塑相关Mac的特征（源自论文[1]）

单核吞噬系统的谱系分析

为了系统的评估单核吞噬细胞潜在起源和细胞分化，研究者使用拟时序分析来探究细胞谱系关系。研究得到了两种不同的轨迹，单核细胞沿轨迹1向EAMs分化，终点分化为炎症反应强烈的Mac，其损伤评分最高；轨迹2是由稳态组织驻留Mac组成，在UlR肾脏中发现从组织驻留Cluster4向修复促进型Mac的分化路径，并且终点的伤口愈合评分最高，在术后第1天，部分驻留Cluster4转变为增殖型Mac，表明了一个过渡性分化状态，这表明肾脏损伤会诱导损伤部位的驻留Mac局部增殖和自我更新，以调节AKI后早期的伤口愈合。所有研究支持在缺血性肾脏中存在以上两种主要的细胞谱系，肾内固有的Mac分化为修复型Mac亚群作为损伤后的修复响应，而EAMs则转变为促炎型Mac并参与慢性炎症和纤维化。

图5 Mac在修复和纤维化过程中的运动轨迹（源自论文[1]）

成纤维细胞与EAMs的相互作用

 

对照组的肾脏仅有少量的内皮细胞与近端肾小管细胞之间有相互作用，而UlR后观察到细胞间通讯增加，尤其是在晚期纤维化阶段。研究者发现EAMs可以通过配体-受体对如Grn-Sort1，Vsir-Igsf11，Anxa1-Fpr1及Anxa1-Fpr2直接与内皮细胞、成纤维细胞、修复的PT和中性粒细胞相互作用。在EAMs和成纤维细胞之间发现了IGF1-IGF1r，Fn1-CD44，Fn1-Sdc4，Grn-Sort1和Tnfsf12-Tnfrsf12a受配体对，这些促进纤维化的通信对与促纤维化信号相关联，并在激活成纤维细胞和ECM重塑的调节中至关重要，研究者还识别出源自EAMs的IGF1是在UlR后期（第14天和第28天）与大多数成纤维细胞目标相互作用的最广泛配体。

为了进一步探讨AKl和CKD中浸润的IGF1+ Mac的潜在病理意义，研究者利用一个AKl-CKD队列，发现在CKD患者的肾脏组织中，纤维化区域与IGF1∕CD68共表达呈正相关，CKD患者尿沉渣和上清液中IGF1的表达显著增加，并且与GFR-EPI呈负相关。研究者通过WB和mIHC检测IGF1对成纤维细胞的影响，在IGF1刺激后，Col1a1，a-SMA，Vim和PCNA的表达在成纤维细胞中显著增加。因此IGF1+ Mac可能是从AKI过渡到CKD的关键参与者。

图6 Mac与其他细胞之间通信的配体-受体的相互作用（源自论文[1]）

 

本文中涉及的mIHC实验由艾克发生物提供相关技术支持，设计Panel：IGF1、IGF1r、CD68、α-SMA、DAPI，利用AlphaXTSA^®多靶点免疫组化染色试剂盒（CAT#AXT37100031）及AlphaXPainter^®X30直观检测各标志物的表达情况，证实了IGF1+CD68+巨噬细胞和IGF1r+α-SMA+成纤维细胞主要定位于小管间质。

mIHC Panel：IGF1、IGF1r、CD68、α-SMA、DAPI

 

总结

AKI到CKD的转变是一个重要的临床议题，因为这关系到患者的长期预后以及可能发展为终末期肾病的风险，理解这一过程中的免疫反应机制对于开发新的治疗策略至关重要。研究中通过建立UIR小鼠模型借助单细胞RNA测序、空间转录组学Visium、mIHC及流式细胞术等方法，阐明了AKI到CKD转化过程中Mac异质性的动态变化规律，识别出与肾纤维化进程紧密关联的新Mac亚型EAMs，为进一步理解AKI向CKD演变机制提供了重要线索，并为临床干预提供潜在靶标。

 

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